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高效液相色谱法测定黄蜀葵花总黄酮胶囊中的 金丝桃苷和槲皮素 -3’- 葡萄糖苷

   黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵的干燥花,黄蜀葵花总黄酮是从黄蜀葵花中提取的总黄酮,其成分中含量较高的金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷具有增加脑血流量、阻断脑缺血后脑细胞Ca2+内流、抗自由基和抑制NO生成等药理作用,对缺血性脑损伤有很好的保护作用。因此黄蜀葵花总黄酮对脑血管疾病具有理想的疗效。由于黄蜀葵花总黄酮胶囊尚处于临床前阶段,目前还没有测定总黄酮中金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷含量的方法,只有用高效液相色谱法测定黄蜀葵花酒精浸膏中金丝桃苷含量的文献报道。为了制定该药质量标准,笔者建立了用高效液相色谱同时测定黄蜀葵花总黄酮中金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷含量的方法,该方法专属性强,精密度高,重复性好,为黄蜀葵花总黄酮胶囊质量标准的制定提供依据。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

   液相色谱仪:LC20ATvp型;检测器:SPD20Avp型,日本岛津公司;

   电子分析天平:AG285型;感量为0.001mg,瑞士梅特勒–托利多公司;

   超声波清洗器:JK300型,合肥金尼克机器制造有限公司;

   黄蜀葵总黄酮胶囊:批号分别为201809182018091020180912,安徽省医学科学研究院;

   金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷对照品:纯度均大于98%,自制,用前在105℃条件下干燥至恒重;

   乙腈、甲醇:色谱纯;磷酸:分析纯

   实验用水为超纯水。

1.2溶液配制

   金丝桃苷和槲皮素-3-葡萄糖苷对照品混合溶液:精密称取6.116mg金丝桃苷,5.522mg槲皮素-3-葡萄糖苷,置于50mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至标线,配制成金丝桃苷和槲皮素-3-葡萄糖苷的质量浓度分别为122.32110.44μgmL的对照品混合溶液。

   系列混合标准工作溶液:分别移取对照品混合溶液123456mL置于610mL容量瓶中,用甲醇定容至标线,配制成含金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷的系列混合标准工作溶液,其中,金丝桃苷的质量浓度分别为12.23224.46436.69648.92861.1673.392μgmL;槲皮素-3-葡萄糖苷的质量浓度分别为11.04422.08833.13244.17655.2266.264μgmL

1.3仪器工作条件

   色谱柱:InertSustainC18(250mm×4.6mm5μm,日本岛津公司);柱温:30℃;流动相:乙腈–0.5%磷酸水溶液(2278);流量:1.0mLmin;进样体积:10μL;检测波长:360nm

1.4样品处理

   20粒胶囊内容物,研磨,混匀,精密称取5060mg,置于100mL量瓶中,加入甲醇溶解并定容至标线,超声15min,过滤,待测。

2结果与讨论

2.1提取条件选择

   分别以甲醇、乙醇、50%乙醇为提取溶剂,对黄蜀葵花总黄酮进行提取,并测定样品中金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷的含量,以两者指标总和计算提取率,计算结果依次为99%94%95%,甲醇的提取率最高。以甲醇为提取溶剂,提取时间分别为510152025min时,黄蜀葵花总黄酮的提取率依次为92%96%99%99%99%。由此可知,随提取时间的增加提取率随之增高,15min后提取率趋于稳定,因此选择提取时间为15min

2.2色谱条件优化

   以不同比例的甲醇0.5%磷酸水溶液为流动相,金丝桃苷和槲皮素-3-葡萄糖苷的分离效果均不理想,分离度最大为1.2;选择乙腈–0.5%磷酸水溶液为流动相,乙腈和0.5%磷酸水溶液的体积比为2278,在此色谱条件下,对照品溶液和样品溶液的色谱图如1所示。由图1可以看出,金丝桃苷和槲皮素-3-葡萄糖苷的峰形对称,分离度大于1.5,符合测试要求。流动相中加入适量磷酸,可使峰形不拖尾。

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2.3线性方程及检出限

   1.3仪器工作条件下对系列混合标准工作溶液进行测定,以溶液的质量浓度(x)为横坐标,色谱峰面积(y)为纵坐标,绘制标准工作曲线。连续测定空白溶液(甲醇)11次,以3倍信噪比对应的溶液浓度平均值作为方法检出限。线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表1。由表1可知,金丝桃苷和槲皮素-3-葡萄糖苷的质量浓度分别在12.23273.39211.04466.264μgmL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,相关系数均为0.9999,检出限分别为200180ngg

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2.4精密度试验

   20180918号总黄酮胶囊20粒内容物,研磨,按1.4方法进行样品处理,在1.3仪器工作条件下连续测定6次,结果见表2

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2.5稳定性试验

   20180918号胶囊20粒内容物,研磨,按1.4方法进行样品处理,在1.3仪器工作条件下,分别在0481224h时测定金丝桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷的色谱峰面积,结果见表3

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由表3可知,金丝桃苷色谱峰面积相对标准偏差为0.61%,槲皮素-3-葡萄糖苷色谱峰面积相对标准偏差为1.18%,表明样品溶液在24h内基本稳定,该方法稳定性良好。

2.6加标回收试验

   取适量的20180918号样品(金丝桃苷含量5.04%,槲皮素-3-葡萄糖苷含量2.73%),分别加入一定量的金丝桃苷及槲皮素-3-葡萄糖苷对照品混合溶液,按1.4方法进行样品处理,在1.3仪器工作条件下测定,结果见表4

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3结语

   利用液相色谱法测定黄蜀葵花总黄酮胶囊中金丝桃苷和槲皮素-3-葡萄糖苷的含量,采用乙腈–0.5%的磷酸水溶液(2278)作为流动相,所得色谱峰形对称,分离度符合要求。该方法具有专属性强,精密度高,重复性好的特点,为控制黄蜀葵花总黄酮胶囊的质量提供理论依据。