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高效液相色谱法测定食用植物油中 6 种合成抗氧化剂(二)

结果与讨论

2.1 检测方法优化

2.1.1 流动相及流量

  结合化合物的结构和性质,借鉴 GBT 219272008《食品中叔丁基对苯二酚的测定 高效液相色谱法》和 GBT5009.292003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》中相应的检测方法,初步选择乙腈、甲醇作为流动相中的有机相,水、乙酸水溶液、乙酸铵水溶液作为流动相中的水相。

  分别比较了乙酸水溶液 + 甲醇、水 甲醇、乙酸铵水溶液 甲醇、乙酸水溶液 乙腈、水 乙腈 5种流动相对测定结果的影响。结果表明,乙酸水溶液 甲醇作为流动相时,无论怎样调整洗脱梯度,各化合物的色谱峰均不够尖锐,跨度较大,不利于定量,且极性相近的化合物易重叠,这对定性、定量均有一定的困难;水 甲醇、水 乙腈这两类流动相也有类似的问题;乙酸铵水溶液 甲醇作为流动相时,山梨酸保留时间约为 6.5 min,没食子酸的保留时间小于 2.5 min,而 BHT 的保留时间大于 15 min,这说明乙酸铵水溶液的极性过大,故可以确定乙酸铵水溶液 – 甲醇不适合作为此 种化合物分析的流动相。综合考虑,确定流动相为乙酸水溶液 乙腈。选择 1% 乙酸水溶液 乙腈作为流动相时,峰形尖锐对称,但 种化合物的保留时间不合适,如没食子酸和 PG 的保留时间偏短,而 BHA 和 BHT 的保留时间偏长;选择水 乙腈作为流动相时,峰形尖锐且对称,没食子酸和 PG 的保留时间适中,约为 45 min,但山梨酸、TBHQBHABHT 的保留时间则偏长;结合上述两种流动相的优势,最终选择 0.4% 乙酸水溶液 乙腈作为流动相。

  采取梯度洗脱,以减少分析时间,提高分离效率,为了更好地控制各化合物的保留时间,最终确定流动相的流量为 0.8 mLmin

2.1.2 检测波长

流动相和梯度洗脱程序确定后,采集检测波长分别为 210251280460 nm 时的光谱,种合成抗氧化剂标准样品吸收光谱图见图 1

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由图 1 可知,种合成抗氧化剂的 λmax 各不相同,PG :λmax = 298 nm TBHQ :λmax = 210 nm BHA :λmax = 216 nm BHT :λmax = 210 nm ;没食子 酸:λmax = 298 nm ;山 梨 酸:λmax = 251 nm。 但TBHQ 的光谱图显示其在 260320 nm 之间有完整吸收峰,而 BHT 则在 260300 nm 之间有完整吸收峰,这两个吸收峰应为 TBHQ 和 BHT 的特征吸收峰。多波长同时检测能选择各化合物的最佳吸收波长,能有效提高目标化合物的检测灵敏度,但其定性定量谱图则比较凌乱,综合考虑,最终选择 280 nm作为 种合成抗氧化剂的检测波长,在此波长下,各形态完全基线分离,峰形对称、尖锐,满足检测要求。

2.2 提取方法优化

2.2.1 提取方式

  依据相关文献及化合物本身的结构性质分析,结合 GBT 219272008《食品中叔丁基对苯二酚的测定 高效液相色谱法》中 TBHQ 的提取方法,并根据简单便捷、减少交叉污染的原则,最终选择超声提取方式。

2.2.2 提取溶剂

  6 种合成抗氧化剂均为极性相对较强的化合物,其中 种为脂溶性物质,种为水溶性物质。提取溶液应选择与流动相较为一致的试剂,因此分别考察了甲醇 – 水溶液、乙腈 – 水溶液、乙腈 – 乙酸水溶液、乙腈等有机溶剂作为提取溶液时 种合成抗氧化剂的回收效果。

  首先固定超声时间为 15 min,选择最优的提取溶剂。准确称取 2 g 油脂样本,加入 10 mL 正己烷溶解,然后用 10 mL 甲醇 – 水 (91) 溶液超声萃取次,合并萃取液,氮吹浓缩,再用甲醇 – 水 (91) 溶液定容至 10 mL,过滤膜,上机检测,TBHQBHABHT 的 回 收 率 为 60.4%71.3%PG,山 梨 酸 和 没食子酸的回收率为 75.7%80.9% ;选用乙腈 – 水(91) 溶液作为提取溶剂时,TBHQBHABHT 的回收率为 66.7%75.6%PG,山梨酸和没食子酸的回收率为 78.2%84.1% ;选用乙腈 – 乙酸水 (91)溶液作为提取溶剂时,TBHQBHABHT 的回收率为 56.1%68.6%PG、山梨酸、没食子酸的回收率为 76.9%87.3% ;选用乙腈作为提取溶剂时,种合成抗氧化剂的回收率为 71.2%80.6%。结果表明,提取溶剂中减少水或乙酸水强水溶性成分,有利于更好地提取油脂中的 TBHQBHABHT,而对G、山梨酸、没食子酸 种化合物的影响不大,因此先将正己烷和乙腈按照 1的体积比例混溶,待静止后分层,可以得到饱和正己烷的乙腈,然后按照上述方法提取油脂中的 种合成抗氧化剂,回收率为82.4%90.6%,该方法满足检测要求,减少了提取次数,而且避免了氮吹。为了提高样品的提取效率,简化提取步骤,最终确定提取溶剂为饱和正己烷的乙腈溶液。

2.2.3 超声时间

  适当增加超声时间,萃取液定容至 10 mL,过滤膜,上机检测。结果表明,回收率在 79.4%89.9%之间,没有显著下降。考察超声时间分别为 510152025303540 min 时,种化合物的加标回收率变化趋势见图 2。由图 可知,个别化合物的回收率在不同时间段有显著差异,总体而言,随着超声时间的延长,种化合物的回收率升高,当超声时间达到 25 min 后,回收率变化不明显,因此选择超声时间为 25 min

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2.3 色谱图

  6 种抗氧化剂标准样品的液相色谱图见图 3。由图 可知,种抗氧化剂在 15 min 内即可分离完全,峰形尖锐,表明该方法适于进行定量分析。

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2.4 线性方程及检出限

  按照 1.5 方法绘制标准工作曲线。选取空白样本,加入已知浓度混合对照品溶液,稀释至最低出峰浓度,取 倍信噪比(SN)时作为方法的定性检出限浓度,取 10 倍信噪比时作为方法的定量检出限浓度。根据加入空白样质量、定容体积、检出限浓度计算该方法的检出限。种抗氧化剂的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表 2

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由表 2 可知,种抗氧化剂的质量浓度在 0.110μgmL 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系,相关系数大于 0.999,方法检出限为 1.0~2.5 mgkg

2.5 精密度与加标回收试验

  选择橄榄油、花生油、大豆油 3 种空白样品,分别准确称取约 2.000 g 共 18 份,每 份为一组,分别添加 0.21.02.0 μgmL 的混合标准溶液,按照 1.4方法进行样品前处理,在 1.2 仪器工作条件下连续测定 次,测定结果见表 3。由表 可知,样品加标回收率为 79.6%108.9%,测定结果的相对标准偏差为 2.03%5.77%。表明该方法具有良好的精密度和准确度。加标样品的色谱图见图 4

结语

通过优化流动相、检测波长、提取溶剂、提取时间等,建立了高效液相色谱法测定食用植物油中 6种合成抗氧化剂的含量。该方法简单、快速,能有效检测食用植物油添加的抗氧化剂。